目的:通过研究Notch-1/Twist-1信号通路参与Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化(EMT)作用,为阐明肺纤维化(PF)发病机制提供理论依据。方法:动物实验设对照组和博莱霉素(BLM)组(n=15)。气管注射BLM(7 500 U/kg)诱导肺纤维化大鼠模型,造模后28 d取左肺下叶固定于10%福尔马林中,进行HE、Masson及转化生长因子-β1(TGF-β1)免疫组化染色。体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN),细胞实验设对照(Control)组、TGF-β1(5 ng/ml)组、TGF-β1+ Notch-1 siRNA阴性对照组(NC siRNA, 100 pmol/L)和TGF-β1+Notch-1 siRNA干扰组(Notch-1 siRNA, 100 pmol/L),每组设9个复孔。细胞先用NC siRNA或Notch-1 siRNA预处理24 h,再用TGF-β1处理48 h。检测肺组织和(或)II型肺泡上皮细胞内TGF-β1、I型胶原(collagen I)、III型胶原(collagen III)、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙粘蛋白(N-Cadherin)、Notch-1、Notch-1胞内域(NICD)、Hes-1和Twist-1 mRNA和(或)蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与对照组相比,BLM组肺泡萎缩、塌陷并发生融合,肺泡间隔明显增宽,可见大量炎性细胞的浸润。肺间质胶原纤维沉积明显增多,collagen I和collagen III的表达明显增加(P＜0.01);另外,肺BLM组织中E-cadherin和ZO-1表达明显下降而Vimentin和N-cadherin的表达明显增加(P＜0.01);同时,BLM组肺组织TGF-β1、Notch-1、NICD、Hes-1和Twist-1的表达也明显上调(P＜ 0.01)。细胞实验结果显示,与Control相比,TGF-β1组Notch-1、NICD、Hes-1、Twist-1、collagen I和collagen III的表达明显升高,同时E-Cadherin和ZO-1的表达明显降低而Vimentin和N-cadherin的表达明显升高(P＜0.01)。与TGF-β1组相比,Notch-1 siRNA能够明显降低TGF-β1诱导Notch-1、NICD、Hes-1和Twist-1的表达(P＜0.05或P＜ 0.01),同时E-Cadherin和ZO-1的表达明显升高而Vimentin和N-cadherin的表达明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。另外Notch-1 siRNA还能够明显降低TGF-β1诱导的collagen I和collagen III的表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论:Notch-1/Twist-1信号通路参与了Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT,可能参与了肺纤维化的发生发展。

目的:探讨白细胞介素-17A(IL-17A)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的干预作用及其机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为野生型空白对照组、野生型COPD组和IL-7A敲除COPD组,每组20只。野生型空白对照组小鼠不做任何处理,其余两组小鼠暴露于香烟烟雾(1支/次,4次/日,每次45 min,每次间隔时间为1 h,总干预时间为90 d)制作COPD模型。干预结束24 h后,利用动物肺功能检测系统测定小鼠肺功能。收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),测定BALF细胞计数和分类。收集小鼠肺组织,采用流式细胞法测定气道上皮IL-17A表达水平,采用酶联免疫吸附法测定肺组织炎症因子水平。采用蛋白免疫印迹法测定小鼠肺组织JNK/AP1信号通路蛋白表达水平。结果:与野生型空白对照组小鼠比较,野生型COPD组小鼠气道上皮IL-17A表达水平明显升高,吸气峰流速(PIF)和呼气峰流速(PEF)明显降低,BALF中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数明显升高,肺组织CXC类趋化因子1(CXCL1)、CXC类趋化因子2(CXCL2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)表达水平明显升高,JNK、cJun和cFos磷酸化水平及AP1表达水平明显升高(P＜0.05);与野生型COPD组小鼠比较,IL-7A敲除COPD组小鼠气道上皮IL-17A表达水平明显降低,PIF和PEF明显升高,BALF中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数明显降低,肺组织CXCL1、CXCL2、IL-1β和IL-6表达水平明显降低,JNK、cJun和cFos磷酸化水平及AP1表达水平明显降低(P＜0.05)。结论:香烟烟雾可诱导小鼠气道上皮产生IL-17A,降低(或抑制)IL-17A的产生(或表达或分泌),通过抑制JNK/AP1信号通路,减轻COPD气道炎症反应,改善COPD小鼠肺功能。

目的:探讨左旋卡尼汀(LC)对脂多糖(LPS)损伤的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)的保护作用及自噬、凋亡的影响。方法:采用体外培养的小鼠PMVECs,分为对照组(Control组)、LPS组(10 μg/ ml,3、6、12、24 h)、LPS(10 μg/ ml,24 h)+LC(终浓度为2.5、5、10 μg/ml)(LC组)。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡,细胞免疫荧光染色法检测自噬小体,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3及凋亡蛋白Caspase-3的含量,CCK-8法检测细胞活力。结果:① 与Control组比较,LPS 6 h、12 h、24 h组PMVECs细胞活力显著受到抑制,细胞凋亡率、自噬蛋白LC3Ⅱ表达显著增高(P均＜0.01),LC3蛋白阳性表达。②与LPS 24 h组比较,各浓度LC组PMVECs细胞活力显著提高、自噬蛋白LC3II表达水平显著升高(P均＜0.01),而PMVECs凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3表达水平均明显降低 (P＜0.05)。结论:LC具有提高LPS刺激的小鼠PMVECs活性、促进PMVECs自噬、抑制凋亡的作用。

目的:探讨微小RNA-133b(miR-133b)靶向抑制富含谷氨酰胺三十四肽重复序列的小蛋白质分子(SGTB)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法:采用100 μg/ml的oxLDL诱导人脐静脉血管内皮细胞(EVC-304)24 h构建血管内皮细胞损伤模型。将EVC-304细胞分为对照组、oxLDL组(oxLDL处理)、oxLDL+miR-NC组(转染20 nmol/L miR-NC+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b组(转染20 nmol/L miR-133b mimics+oxLDL处理)、oxLDL+si-NC组(转染20 nmol/L si-NC+oxLDL处理)、oxLDL+si-SGTB组(转染20 nmol/L si-SGTB+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b+pcDNA组(转染20 nmol/L si-SGTB和pcDNA+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b+pcDNA-SGTB组(转染20 nmol/L si-SGTB和pcDNA-SGTB处理)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印记(Western blot)检测miR-133b和SGTB的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-133b对SGTB的靶向调控关系。结果:与对照组比较,oxLDL诱导后EVC-304细胞miR-133b、Bcl-2的表达水平显著降低(P＜0.05),SGTB、Bax的表达水平显著升高(P＜0.05),MDA含量和细胞凋亡率显著增加(P＜0.05),SOD和GSH-Px活性显著降低(P＜0.05)。过表达miR-133b或干扰SGTB均可抑制oxLDL诱导的EVC-304细胞凋亡和氧化应激损伤(P＜ 0.05)。miR-133b与SGTB直接结合,过表达miR-133b显著下调SGTB表达(P＜0.05),抑制miR-133b显著上调SGTB表达(P＜0.05)。过表达SGTB可逆转过表达miR-133b对oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响(P＜0.05)。结论:miR-133b通过靶向抑制SGTB的表达,可减轻oxLDL诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

目的:探究miR-155-3p对人NK/T细胞淋巴瘤细胞HANK1恶性行为的影响及潜在机制。方法:Targetscan数据库预测miR-155-3p的靶基因,培养对数生长期HANK1细胞,将细胞分为空白组、过表达组、对照组及干扰组,利用细胞转染技术依次转入pENTER-puro空白载体、pENTER-miR-155-3p过表达载体、GV248对照载体、GV248-miR-155-3p siRNA干扰载体。同时放线菌素D(ActD)处理各组细胞,实时荧光定量PCR技术检测各组细胞miR-155-3p、EAF1、β-catenin及c-Myc的表达水平,并分析各组细胞ActD处理后EAF1 mRNA降解速率(n=5),Western blot检测细胞EAF1、β-catenin及c-Myc蛋白表达情况(n=3),CCK-8检测细胞恶性增殖能力变化(n=5)。结果:与空白组相比,过表达组细胞miR-155-3p、β-catenin及c-Myc表达水平显著增高,EAF1表达水平降低且EAF1 mRNA半衰期缩短,细胞恶性增殖能力增强(P均＜0.05);与对照组相比,干扰组细胞miR-155-3p、β-catenin及c-Myc表达水平显著降低,EAF1表达水平升高且EAF1 mRNA半衰期延长,细胞恶性增殖能力降低(P均＜ 0.05)。结论:miR-155-3p可促进EAF1 mRNA降解及HANK1细胞恶性增殖能力。

目的:探讨在脂多糖(LPS)所致细菌脓毒症免疫抑制中树突状细胞(DCs)程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)的表达情况及其相关信号通路。方法:细菌脂多糖刺激骨髓来源树突状细胞诱导淋巴细胞免疫抑制模型,实验分为5组:对照组(Con)、脂多糖组(LPS)、2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮+脂多糖组(LY294002+LPS)、吡咯烷二硫代甲酸铵盐+脂多糖组(PDTC+LPS)和脂多糖+封闭PD-L1组(LPS+αPD-L1)。小鼠骨髓来源单核细胞用含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF 10 ng/ml)和白介素4(rmIL-4 1 ng/ml)的10%胎牛血清1640培养基于CO₂培养箱37℃静置培养4 d后,LPS(10 ng/ml)处理DCs静置12 h获得PD-L1高表达的DCs作为免疫抑制刺激细胞。通路抑制剂LY294002(10 μmol/L)、PDTC (20 μmol/L)作用1 h阻断PI3K和NF-κB信号。采用流式细胞分析、激光共聚焦显微成像检测LPS诱导树突状细胞PD-L1表达及磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶B (PI3K/AKT) 信号通路活化情况;BrdU细胞增殖实验和γ-干扰素酶联免疫斑点实验检测LPS诱导树突状细胞PD-L1表达上调对抗原特异性T细胞增殖反应及细胞毒性T细胞杀伤作用的影响。结果:与对照组比较,LPS组DCs表面PD-L1阳性细胞百分比升高(P＜0.01),PD-L1荧光信号强度增强,且主要分布于细胞表面和细胞质,DCs介导的T细胞增殖水平降低(P＜0.01),γ-干扰素斑点形成细胞数下降(P＜0.01)。与LPS组比较,LY294002+LPS组、PDTC+LPS组和LPS+αPD-L1组PD-L1荧光信号强度降低,T细胞增殖水平升高(P＜0.01),γ-干扰素斑点形成细胞数上升(P＜0.01),改善树突状细胞介导的T细胞免疫抑制现象。 结论:PD-L1是介导脂多糖所致细菌脓毒症免疫抑制的关键分子,PI3K信号、NF-κB信号也参与此免疫抑制过程。

目的:探讨莪术醇(CC)对非酒精性脂肪性肝(NAFLD)大鼠模型肝功能和肝纤维化的影响及机制。方法:采用高脂饮食构建非酒精脂肪肝炎(NASH)伴肝纤维化的大鼠模型,将60只SD大鼠随机分为:空白对照组、模型组(NASH)、NASH+复方鳖甲软肝片(CBT)组(阳性对照组)、NASH+CC组(25、50、100 mg/kg),每组10只。测量大鼠肝脏占体重的百分比,测量大鼠高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平,HE染色观察肝纤维化情况,免疫组化检测鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及肝组织核因子κB p65(NF-κB p65)的阳性染色情况,蛋白印迹(Western blot)检测α-SMA、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白表达及Toll样受体-4(TLR4)、转化生长因子激活激酶-1(TAK1)、NF-κB p65、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)蛋白的表达情况,酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝组织中白介素(IL-6、IL-10、IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。结果:与空白对照组相比,模型组大鼠HDL、 IL-10含量、MMP-1蛋白表达量显著降低(P＜0.05),TG、ALT、AST、肝组织P65阳性率,α-SMA、TIMP-1、TLR4、TAK1、NF-κB p65、VCAM-1表达、IL-6、TNF-α及IL-1β含量显著升高(P＜0.05)。与模型组相比,CBT和CC处理后大鼠HDL、 IL-10含量、MMP-1蛋白表达量显著升高(P＜0.05),TG、ALT、AST、肝组织P65阳性率,α-SMA、TIMP-1、TLR4、TAK1、NF-κB p65、VCAM-1表达、IL-6、TNF-α及IL-1β含量显著降低(P＜0.05),其中模型+CC组以高浓度组改善最显著(P＜0.05),但各剂量改善幅度均低于模型+CBT组(P＜0.05)。结论:莪术醇通过调节TLR4、TAK1、NF-κB p65信号通路,减轻炎症反应,改善肝功能,从而缓解非酒精性脂肪肝肝肝纤维化,且在一定范围内呈浓度依赖性。

目的:探讨牛磺酸上调基因1(TUG1)在肝纤维化中的作用机制。方法:按照文献建立TGF-β1(5 ng/ml)刺激的活化肝星状细胞模型和经典的1%DMN(1 ml/kg/d)致大鼠肝纤维化模型,将肝纤维化大鼠和活化肝星状细胞(HSC)均分为模型对照组、阴性对照组(沉默TUG1阴性对照)、siRNA干扰组(TUG1基因沉默组)。实验结束后利用苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠肝脏组织病理变化;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、蛋白免疫印记(Western blot)分别测定大鼠肝组织及活化肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TUG1、I型胶原蛋白(collagenI)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)、Smad2、Smad3表达水平。结果:肝组织病理学检查显示,沉默TUG1能够明显缓解肝脏纤维化病理改变,Western blot结果显示,沉默TUG1能够显著降低大鼠肝组织和活化肝星状细胞中TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3基因与蛋白表达水平(P＜0.05)。与模型对照组相比,阴性对照组的TUG1、α-SMA的蛋白与基因水平明显升高(P＜0.05)。与模型对照组和阴性对照组相比,siRNA干扰组中TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3的蛋白和基因水平显著降低(P＜0.05),而在模型对照组和阴性对照组中TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3的蛋白和基因表达水平之间差异无显著性。结论:TUG1在肝纤维化组织和活化的肝星状细胞中显著上调,沉默TUG1可能通过抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路改善1%DMN致大鼠肝纤维化病理损伤,降低活化肝星状细胞中纤维化相关蛋白水平,发挥抗肝纤维化的作用。

目的:探讨莱菔子乙醇提取物(AERS)对ApoE^-/-小鼠血脂血糖及肝脂肪变性的影响及其机制。方法:随机将60只ApoE^-/-小鼠分为对照组(CG)、生理盐水组(NG)、罗格列酮组(RG)、AERS治疗组,后者再分成AERS低、中、高剂量组(AERS-L/M/H),每组10只。除CG常规饲料外,其他动物均以高脂高糖高盐饲料饲养9周,CG和NG分别每天以等容量NS灌胃1次,RG每天灌胃罗格列酮(1.33 mg·kg^-1,NS稀释成等容量溶液,每次0.2 ml·10 g^-1),AERS组动物每天分别予AERS灌胃(100、300和900 mg·kg^-1)9周后。肝病理学观察,检测FPG、FIns,计算胰岛素抵抗指数(IRI)和肝系数(LC)。检测血清ALT、AST、瘦素(LEP)、TNF-α及血脂水平(TC、FFA等)。Western blot检测肝脂质代谢相关蛋白表达(HMG-R、LDL-R、LEP-R)。结果:与CG相比,NG和RG肝脏外观(色泽、肿胀情况等)和病理学(脂肪变性、肝细胞坏死等)改变明显,而AERS-M/H与CG相似;与CG相比,血清FPG、Fins、IRI、ALT、AST、TNF-α、LC、TG、LDL-C、FFA、LEP等指标明显升高(P＜0.05);与NG相比,AERS呈现剂量依赖性降低(P＜0.05);与RG相比,AERS-H的FPG、Fins明显升高(P＜0.05),而IRI明显降低(P＜0.05);与NG和RG相比,AERS组的HMG-R和LEP-R蛋白表达呈剂量依赖性减少,而LDL-R蛋白表达呈剂量依赖性增加(P＜0.05)。结论:AERS能阻止高脂高糖饲料诱导ApoE^-/^-小鼠血脂血糖升高及肝脂肪变性,其机制与减少FFA和LEP的生成,抑制TNF-α、HMG-R、LEP-R蛋白表达和促进LDL-R的蛋白表达有关。

目的:探讨模拟海拔6 000 m高原低氧环境对小鼠脾脏铁代谢的影响。方法:将C57BL/6小鼠按体重随机分为常压常氧组(Nor)和低压低氧组(HH)。HH组小鼠放置于低压低氧动物实验舱内,模拟急性海拔6 000 m高原低氧环境,控制光照时间比大约12 h∶12 h。Nor组置于同等条件的常压常氧环境。HH组又分为低氧12 h组(HH-12 h)和3 d组(HH-3 d),对照组对应分为(Nor-12 h及Nor-3 d),每组9只小鼠。采用血常规检测、HE染色、组织铁染色、蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学(IHC)综合评价模拟高原低氧环境下小鼠脾脏铁代谢情况。结果:与相同时间点Nor组相比:①HH-12 h组小鼠红细胞数(RBC)、血红蛋白量(HGB)、红细胞压积(HCT)均无明显变化。HH-3 d组RBC、HGB及HCT均显著增加(P＜0.05),平均血红蛋白量(MCH)在HH-12 h和HH-3 d组均无显著变化。②与Nor-3 d相比,HH-3 d组小鼠脾脏明显增大,HE染色显示脾窦变窄,铁染色结果显示HH-3 d组脾脏红髓中铁含量明显增加。③WB结果显示,HH-3 d组低氧诱导因子1α(HIF-1α),转铁蛋白受体1(TfR1),铁输出蛋白(Fpn)表达均显著增加,而铁蛋白(Ft-L)的表达显著降低(P＜0.05);IHC结果也与WB结果一致,高原低氧暴露3 d后脾脏红髓TfR1、Fpn表达和分布均明显增多,Ft-L表达分布明显减少。结论:模拟海拔6 000 m高原低氧暴露3 d后小鼠脾脏截留处理RBC增多,脾索铁沉积,脾脏组织细胞内铁动员加速。高原低氧下脾脏铁代谢异常可能是引起高原低氧暴露下红细胞病理性增多甚至造成高原红细胞增多症的主要原因。

目的:探讨在低氧联合脂多糖(LPS)作用下,星形胶质细胞中B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19-kD相互作用蛋白3(BNIP3)的表达和炎症反应变化。方法:将体外培养的原代星形胶质细胞和神经元进行下列分组:常氧组、LPS组、低氧组和LPS+低氧组(每组设置3个复孔)。LPS处理后,低氧组和LPS+低氧组放入低氧细胞孵箱,LPS组和常氧组放入正常的细胞孵箱。LPS浓度:100 ng/ml,氧气浓度为0.3%。处理时间为24 h。原代的星形胶质细胞进行上述的分组,时间点设为6 h、12 h和24 h。Western blot检测BNIP3的表达变化,RT-PCR和ELISA分别检测星形胶质细胞的肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)mRNA水平变化和分泌情况。结果:与常氧组比较,低氧组炎症因子的表达没有变化,LPS组和LPS＋低氧组的炎症因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高(P＜0.01);与LPS组比较,LPS＋低氧组炎症因子IL-1β和IL-6 mRNA水平进一步升高(P＜0.05,P＜0.01)。与常氧组比较,低氧组炎症因子的分泌水平没有变化,LPS组和LPS＋低氧组的炎症因子TNF-ɑ和IL-6 分泌水平升高(P＜0.01),IL-1β的水平没有变化;与LPS组比较,LPS＋低氧组炎症因子TNF-ɑ和IL-6分泌水平没有进一步升高。BNIP3在体外培养的神经元和星型胶质细胞中都有表达;在星形胶质细胞中,与常氧组比较,LPS组BNIP3的表达没有变化,低氧组和LPS+低氧组BNIP3的表达明显增加(P＜0.01);在神经元中,与常氧组比较,LPS组BNIP3的表达没有变化,低氧组和LPS+低氧组BNIP3的表达增加(P＜0.05,P＜0.01);与神经元的低氧组比较,星形胶质细胞的低氧组BNIP3的表达增加更明显(P＜0.01)。在星形胶质细胞中LPS联合低氧刺激6、12、24 h后BNIP3蛋白的表达,与常氧组相同时间点比较,LPS组BNIP3的表达没有变化,低氧组和LPS+低氧组BNIP3的表达增加(P＜0.05,P＜0.01);与低氧组相同时间点比较,6 h和12 h的LPS＋低氧组BNIP3的表达增加的更高(P＜0.01)。结论:低氧联合LPS刺激可以增强星形胶质细胞的炎症反应,LPS能增加低氧下星形胶质细胞中BNIP3的表达,提示BNIP3在星形胶质细胞的炎性反应中可能具有一定的调节作用。

目的:探讨辣木叶对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型大鼠认知功能障碍及海马神经细胞凋亡的影响。方法:选取健康SD雄性大鼠50只,随机选取10只作为对照组,40只大鼠给予腹腔注射25 mg/kg STZ构建糖尿病大鼠模型。40只大鼠随机分为模型组、辣木高、中、低剂量组,分别每日灌胃给药2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg辣木叶,对照组和模型组每日灌胃给药等量生理盐水,1次/日,持续给药8周。Morris水迷宫实验评价大鼠学习记忆能力;HE染色及免疫组化染色对大鼠海马神经元切片进行染色,观察各组大鼠海马神经元病理改变的情况及Bax、caspase-3及Bcl-2蛋白表达情况;酶联免疫法(ELISA)检测大鼠海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)。结果:与对照组相比,模型组大鼠血糖值明显提高(P＜0.01),血胰岛素水平明显降低(P＜0.05);与模型组相比,辣木组血糖值显著降低(P＜0.05,P＜0.01),辣木中、高剂量组血胰岛素水平显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。不同剂量组辣木组间比较,给药后3组大鼠FBG及INS无统计学差异(P＞0.05);Morris水迷宫实验的第4-5日,与模型组相比较,辣木各剂量组潜伏期均明显缩短(P＜0.05);辣木不同剂量组目标象限停留时间明显延长(P＜0.05)。炎症因子变化结果,与模型组相比较,辣木低、中、高剂量组TNF-α、IL-6含量及蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。HE染色及免疫组化染色结果显示,与模型组相比较,辣木中剂量组中阳性表达,呈棕黄色,细颗粒状。辣木叶中剂量组(53.21±7.19)能显著减少神经元细胞凋亡的数目(P＜0.01);辣木组中剂量组大鼠海马组织中Bax、caspase-3的蛋白表达及Bax/Bcl-2比例显著降低(P＜0.05)。结论:辣木叶能改善糖尿病大鼠认知功能障碍其作用机制可能与调节Bax、Bcl-2、caspase-3的蛋白表达,降低炎症因子TNF-α及IL-6含量相关。

目的:探讨二甲双胍和西格列汀对胰岛素抵抗糖尿病前期KKAy小鼠胰岛β细胞功能的影响及其机制。方法:将30只6周龄KKAy小鼠随机分为普通饲料喂养组(C组,n=10)及高脂饲料喂养组(n=20),8周龄时将高脂饮食喂养的KKAy小鼠随机分为两组:二甲双胍干预组(Met组,n=10)和西格列汀干预组(SP组,n=10),持续灌胃8周。用口服糖耐量实验(OGTT)检测葡萄糖水平。检测空腹血清胰岛素及血浆脂质水平,计算胰岛素释放指数(HOMA-β)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。留取KKAy小鼠胰腺,连续切片分别胰岛素、胰高血糖素免疫荧光染色,ki67/INS双标记分析β细胞增殖情况、凋亡情况。Western blot方法测定胰腺转录因子PDX-1和MafA蛋白表达情况。结果:① OGTT结果提示,与C组比较,Met和SP组KKAy小鼠的空腹血糖、口服葡萄糖后30、60及120 min的血糖均显著降低(P均＜0.01),血糖时间曲线下面积(AUC)显著降低(P＜0.01,P＜0.01)。与Met组比较,SP组口服葡萄糖后30及60 min的血糖无明显统计学差异,120 min的血糖显著降低(P＜0.05),两组AUC无统计学差异。② 胰岛素耐量试验(ITT)结果提示,与C比较,Met和SP组KKAy小鼠的空腹血糖、注射胰岛素后30、60及90 min的血糖显著减低,ITT血糖曲线下面积(AUC)显著升高(P＜0.01),而Met和SP组之间比较无明显统计学差异。③ C组胰岛中β细胞区域亮度较低,边缘散乱,给予二甲双胍后,β细胞区域及亮度有所增加;给予西格列汀治疗后,β细胞区域及亮度显著增加。C组胰岛中,α细胞在胰岛中分布无序,亮度较大。给予二甲双胍后,α细胞区域有所减少,亮度有所降低,一定程度向胰岛边缘的分布;给予西格列汀后,α细胞区域明显减少,亮度显著降低,在胰岛边缘分布。④ 与C组比较,Met组和SP组胰腺MafA表达水平明显升高,分别为1.63倍,1.58倍(P＜0.01,P＜0.01)。各组间胰腺PDX-1表达情况无显著差异。结论:对胰岛素抵抗糖尿病前期KKAy小鼠,给予二甲双胍可以维持胰岛的功能和形态,给与西格列汀可能促进β细胞增殖,提高胰岛素转录因子MafA的表达水平,防止糖尿病的发生发展。

目的:探讨重复经颅磁刺激(rTMS)联合低剂量氟西汀对慢性不可预知轻度压力(CUMS)抑郁小鼠的影响及其交互作用。方法:取42只雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(Control,7只)和抑郁症模型组(Model,35只),Model组小鼠给予限制塑料管内、鼠笼倾斜、不筑巢、拥挤环境、明暗颠倒、白噪声等6种刺激,每种刺激随机且不同时出现2次,共刺激4周建立CUMS模型。随后35只Model组鼠随机分为CUMS组(8只)、氟西汀组(Fluoxetine,9只)、rTMS组(9只)和rTMS+Fluoxetine组(9只)。Fluoxetine组给予腹腔注射氟西汀5 mg/(kg·d),rTMS组给予10 Hz频率刺激,rTMS+Fluoxetine组给予腹腔注射氟西汀5 mg/(kg·d)和10 Hz频率刺激,Control和CUMS模型组给予相同体积生理盐水腹腔注射和伪刺激,各组均连续干预4周,随后进行行为学实验,最后运用析因设计方差分析方法分析Fluoxetine与rTMS的交互作用。结果:与Control组比,CUMS组小鼠强迫游泳实验中不动时间显著升高(P＜0.05),蔗糖实验中糖喜好程度、旷场实验中心运动次数和体重变化率均显著下降(P＜0.05)。与CUMS组比,rTMS组、Fluoxetine组和rTMS+Fluoxetine组抑郁症小鼠强迫游泳实验中不动时间显著降低(P＜0.01)、蔗糖实验中糖喜好程度和旷场实验中心运动次数显著升高(P＜0.05),其中rTMS+Fluoxetine组联合应用效果更显著(P＜0.05),但体重变化率仅rTMS+Fluoxetine组有变化(P＜0.05)。结论:重复经颅磁刺激和/或氟西汀均能不同程度的改善CUMS小鼠抑郁状态,其中联合应用的干预作用优于单独使用氟西汀或rTMS的效果,且有交互作用。

目的:探讨盐酸罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及分子机制。方法:采用逐步增加药物剂量诱导法建立骨肉瘤多柔比星耐药细胞株(U2OS/DOX),用浓度分别为0、20、50、100 μg/ml的盐酸罗哌卡因处理U2OS/DOX细胞,作为不同浓度盐酸罗哌卡因处理组;将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Livin转染至U2OS/DOX细胞中再用浓度为100 μg/ml的盐酸罗哌卡因处理,记为盐酸罗哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1组、盐酸罗哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin组。MTT检测细胞增殖抑制率及细胞半数抑制浓度(IC₅₀);蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、Livin蛋白表达;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Livin mRNA表达水平。结果:多柔比星浓度大于1 μg/ml时,骨肉瘤细胞U2OS增殖抑制率显著升高,且具有剂量依赖性(P＜0.05);多柔比星浓度大于10 μg/ml时,骨肉瘤细胞骨肉瘤耐药细胞U2OS/DOX增殖抑制率显著升高,且具有剂量依赖性(P＜0.05)。盐酸罗哌卡因处理的U2OS/DOX细胞中P21、Caspase-3、E-cadherin表达水平显著升高,MMP-2表达水平显著降低,细胞增殖抑制率显著升高,克隆形成数显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞迁移、侵袭数显著降低,Livin表达水平显著降低,且呈浓度依赖性(P＜0.05)。过表达Livin部分逆转了盐酸罗哌卡因对细胞U2OS/DOX增殖、迁移、侵袭的抑制作用及凋亡的促进作用。结论:盐酸罗哌卡因能明显抑制对多柔比星具有耐药性的骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,明显促进骨瘤细胞凋亡,其机制可能与Livin有关。

目的:探讨白花蛇舌草多糖提取物(HDPE)对喉癌Hep-2细胞内质网自噬的影响。方法:实验分为对照组、HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA(自噬抑制剂)组,噻唑盐比色法(MTT)检测各组细胞培养24 h、48 h、72 h后增殖抑制率;原位末端转移酶标记法(TUNEL)法检测各组培养48 h细胞凋亡情况;单丹黄酰尸胺(MDC)染色观察各组培养48 h细胞自噬体及自噬溶酶体的变化;透射电镜观察培养48 h细胞内质网周围自噬囊泡的产生情况;蛋白印迹法(Western blot)检测各组培养48 h细胞Beclin-1蛋白(Beclin-1)、微管相关轻链蛋白3Ⅰ(LC3Ⅰ)、微管相关轻链蛋白3Ⅱ(LC3Ⅱ)、葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)、活化转录因子6(ATF6)及CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达。结果:与对照组比较,HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA组细胞增殖抑制率、凋亡指数AI升高,MDC阳性细胞率量降低,内质网周围自噬囊泡减少,GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高,Beclin-1表达降低(P＜0.05);与3-MA组比较,HDPE 400 mg/L组细胞增殖抑制率、凋亡指数AI升高,MDC阳性细胞率、GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高,Beclin-1表达降低(P＜0.05)。结论:HDPE可能通过抑制喉癌Hep-2细胞内质网自噬,促进细胞内质网应激凋亡,进而抑制Hep-2细胞增殖能力。

目的:研究有氧运动联合螺旋藻多糖对糖尿病大鼠学习记忆能力及对海马脑组织p75^NTR信号相关蛋白的影响。方法:采用高糖高脂饮食喂养4周配合低剂量腹腔注射的方法复制Ⅱ型糖尿病大鼠实验模型。成模后随机分为:模型组(B组)、运动+糖尿病组(C组)、螺旋藻多糖+糖尿病组(D组)、运动+螺旋藻多糖+糖尿病组(E组),另设正常对照组(A组)。共5组,每组12只。C组和E组施加6周的有氧游泳训练,D组和E组给予螺旋藻多糖灌胃6周,A组不施加任何干预。用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力;Tunel染色法检测神经元细胞凋亡情况;ELISA法检测BDNF含量,Western blot法检测p75^NTR和cleaved caspase-3蛋白表达,免疫组化法检测cleaved caspase-3表达变化。同时观察大鼠随机血糖、血胰岛素等指标的变化。结果:①与A组比较,B组不同时间点上的体重均显著降低(P＜0.01);与B组比较,C、D、E组在不同时间点上的体重差异均无统计学意义(P均＞0.05)。与A组比较,B组的血糖和胰岛素水平显著升高(P＜0.01);与B组比较,干预各组的血糖和胰岛素水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。②与A组比较,B组寻找平台的逃避潜伏期明显延长(P＜0.01),目标象限时间和穿越平台次数显著减少(P＜0.01);与B组比较,各干预组逃避潜伏期均显著缩短(P＜0.05或P＜0.01),穿越平台次数均显著增加(P＜0.05或P＜0.01),其中以E组效果最好。③与B组比较,干预各组海马神经细胞凋亡减少,p75^NTR、cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P＜0.05或P＜0.01),BDNF含量明显增加(P＜0.05或P＜0.01)。其中以E组效果更为明显。结论:有氧运动与螺旋藻多糖能有效改善糖尿病大鼠学习记忆,其中以两者联合组的效果更为显著,其机制可能与其更好的调节p75^NTR信号相关蛋白的表达,一定程度抑制细胞凋亡,从而有效改善Ⅱ型糖尿病学习记忆,发挥神经保护作用有关。

目的:探讨长期中小强度有氧运动对大鼠左室肌蛋白质组差异性表达的影响,筛选出对中小强度有氧运动刺激敏感的目标蛋白质,丰富运动健身的基础理论及为慢性心血管疾病的康复治疗提供新的思路和实验依据。方法:20只雄性SD大鼠随机分为运动组(E组)和对照组(C组)(n=10)。建立大鼠长期中小强度有氧运动跑台训练模型,采用双向凝胶电泳(2-DE)对大鼠左心室肌全蛋白样品进行分离。采用串联飞行时间质谱蛋白质仪对部分分离后差异表达量上调大于5倍或下调超过80%的蛋白质点进行质谱鉴定。结果:与C组比较,E组大鼠心脏重量指数(HWI)增加了32.0%,具有显著性差异(P＜0.05);与C组比较,E组有71个蛋白质点表达上调≥2倍或下调≥50%,对4个表达上调≥5倍或下调大于等于80%的蛋白质点进行质谱鉴定,鉴定出3个蛋白质和1个未知蛋白质。结论:长期中小强度有氧运动后,大鼠心脏发生了良好的适应性改变;大鼠左心室肌蛋白质组发生了明显变化,长期中小强度有氧运动能有效增强大鼠心肌抗氧化能力。

目的:探讨补充橘皮素对短跑运动员冬训期间血清睾酮、皮质醇水平的影响。方法:将24名短跑运动员配对、随机分为试验组和对照组。冬训期间,试验组补充橘皮素补剂(含橘皮素200 mg),对照组补充安慰剂,为期4周。分别在每周第一天(T1、T2、T3、T4)及干预结束次日(T5)采集血液样本,检测血清睾酮、皮质醇、超氧化物歧化酶(SOD)、促肾上腺皮质激素(ACTH)等指标,并在干预开始和结束时测试身体成分。结果:干预4周后,①对照组的血清皮质醇水平上升,血清睾酮和SOD活性水平显著下降(P＜0.05);②试验组的血清皮质醇(P＜0.05)和ACTH(P＜0.01)均显著下降,血清睾酮维持稳定,SOD活性水平小幅上升;③试验组和对照组的肌肉量均有增加,但前者的增加量显著大于后者。结论:补充4周橘皮素能减少冬训期间高强度运动引起的机体氧化应激反应,维持机体血清睾酮水平稳定,抑制皮质醇过度分泌,促进肌肉合成。

目的:研究12周太极拳运动对中老年轻度高血压患者微血管反应性的影响,并探讨微血管反应性变化的机制。方法:将30名轻度高血压患者分为运动组(53.8±6.3岁)和对照组(52.6±7.5岁),两组人数及性别比例相同。运动组进行12周的太极拳运动,对照组保持原先的生活方式且不做其它规律性的体育运动。两组受试者分别于运动干预前、第6周和第12周结束后进行微血管反应性、血压及血清一氧化氮含量 、一氧化氮合酶活性测试。结果:试验前,两组受试者各指标的基础值均无显著差异(P＞0.05)。运动组,第6周微血管反应性、收缩压、舒张压、一氧化氮含量、一氧化氮合酶活性较基础值无显著变化(P＞0.05),第12周微血管反应性、一氧化氮含量和钙依赖型一氧化氮合酶活性较基础值及对照组显著升高(P＜0.05),收缩压和舒张压较基础值和对照组显著下降(P＜0.05)。对照组,第6周、第12周各指标较基础值均无显著变化(P＞0.05)。结论:12周太极拳运动能提高中老年轻度高血压患者微血管反应性、降低血压,并能提高患者一氧化氮含量、钙依赖型一氧化氮合酶活性,内源性一氧化氮生成增加是太极拳运动提高高血压患者微血管反应性的生物学机制之一。

目的:探究不同强度的游泳训练对小鼠心肌P66shc蛋白的影响。方法:将50只昆明小鼠随机分为对照组(C组)、负重游泳组(E组)、负重游泳+药物组(ER组)、非负重游泳组(P组)、非负重游泳+药物组(PR组),10只/组。C组不运动,E组、ER组、P组、PR组进行4周游泳训练,其中E组、ER组以体重3%负荷进行负重游泳,P组、PR组无负重游泳,60 min/d,每周6次。ER组、PR组小鼠在最后2次运动前腹腔注射PKCδ抑制剂Rottlerin(0.3 mg/kg),C组、E组、P组注射同等剂量生理盐水。在训练结束24 h后取样,Western blot测定小鼠心肌PKCδ、P-PKCδ、P66shc、P-P66shc、NOX2蛋白表达;免疫共沉淀测PKCδ和P66shc;生化分析心肌及血清丙二醛(MDA)、心肌活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)。结果:与C组比较,E组的PKCδ、P-PKCδ、P66shc、P-P66shc、NOX2蛋白表达均明显增加(P＜0.01),血清和心肌MDA水平、心肌ROS明显增加(P＜0.05或P＜0.01),心肌SOD活性降低(P＜0.01),P组的PKCδ、P-PKCδ、P-P66shc和NOX2明显增加(P＜0.05或P＜0.01),心肌SOD活性增强(P＜0.05);与E组比较,ER组PKCδ(P＜0.01)、P-PKCδ(P＜0.01)、P66shc(P＜0.05)、P-P66shc(P＜0.01)、NOX2(P＜0.05)蛋白表达明显减少,P组P66shc蛋白表达显著减少(P＜0.05),心肌MDA(P＜0.01)和ROS(P＜ 0.05)减少,SOD活性增强(P＜0.01);与P组比较,PR组的PKCδ、P-PKCδ、P-P66shc蛋白表达明显减少(P＜ 0.01),NOX2增加(P＜0.05)。结论:两种强度的游泳训练均促使小鼠心肌细胞内PKCδ蛋白及其磷酸化增加;高强度游泳训练可显著增强P66shc蛋白表达及磷酸化水平,导致ROS大量生成,抗氧化酶活性下降;低强度游泳训练增强P66shc磷酸化但不促进其蛋白表达,心肌抗氧化能力增强,产生运动适应。

目的:观察归脾汤(GPT)对心肌缺血大鼠的保护作用。方法:将40只SD大鼠随机分为5组(n=8):空白对照组(Control),模型组(Model)、归脾汤低剂量组(Gpt 7.52 g/kg)、归脾汤高剂量组(Gpt 15.04 g/kg),阳性对照药曲美他嗪组(Trimetazidine,2 mg/kg)。应用饲喂高脂饮食联合注射异丙肾上腺素(ISO)的方法建立大鼠心肌缺血模型,灌胃给药15 d后,各组再次腹腔注射ISO 3 d,随后大鼠进行心电图检测,取材,检测血液中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖(GLU)的变化,HE及Masson染色观察心肌病理改变,Western blot检测心肌组织中CollagenⅠ和CollagenⅢ的蛋白表达。结果:与正常对照组相比,模型组大鼠心电图出现S-T段下移,血清TC、AST、CK、LDH和GLU水平显著升高(P＜0.05),心肌组织CollagenI和CollagenIII蛋白表达显著升高(P＜0.05),心肌受损严重。TG,HDL-C,LDL-C和ALT变化不显著(P＞0.05)。与模型组相比,归脾汤低、高剂量组和曲美他嗪能抑制心肌缺血大鼠心电图S-T段下移,降低血清中TC、AST、CK、LDH和GLU水平(P＜0.05),降低心肌组织CollagenⅢ的表达(P＜0.05),减轻心肌病理损伤程度,归脾汤高剂量组可显著降低CollagenⅠ的蛋白表达(P＜0.05)。结论:归脾汤具有改善心脏功能,减轻心肌缺血损伤的作用,尤以高剂量效果更为显著。

目的:建立一种稳定、快速的SD新生乳鼠原代心肌细胞分离培养改良方法。 方法:取SD新生乳鼠心室,0.12%Ⅱ型胶原酶消化,Percoll密度梯度离心结合5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)化学抑制法纯化心肌细胞,体外培养于含5%马血清的改良DMEM/F12中,次日更换为普通含10%胎牛血清的高糖DMEM继续培养,并比较此改良方法与传统差速贴壁法的差异。 结果:改良法获得的心肌细胞生长良好,接种24 h 后几乎全部贴壁生长,细胞呈三角形、梭形或不规则形,个别细胞出现自主搏动,频率为10～30 beats/min不等。48 h后心肌细胞变长伸出伪足,部分细胞呈现同步搏动, 频率接近50～80 beats/min。72 h后心肌细胞成菊花样交织成网,自发搏动趋于同步,频率加快至80～100 beats/min;96 h后细胞聚集成簇,呈岛屿样,同步搏动频率在100～120 beats/min左右,一周内细胞状态良好。改良法纯化原代心肌细胞的得率((1.17±0.15)×10⁶ vs (1.21±0.22)×10⁶,P＞0.05)和存活率与传统差速贴壁法相当(93.3%±1.4% vs 92.2%±0.7%, P＞0.05 ),但是改良方法获得的原代心肌细胞纯度更高 (94.7%±2.1% vs 89.5%±1.3%, P＜0.05),且用时较短((3.1±0.4)h vs (4.3±0.3)h, P＜0.01)。 结论:改良法获得心肌细胞耗时短、纯度高、结构功能保存完整,且实验重复和稳定性好,是一种理想且简单易行的的原代心肌细胞分离培养方法。